Di quest'ordine fanno parte più di 400 specie. I pipistrelli hanno una dimensione che varia dai tre ai 40 cm di lunghezza e dai 18 ai 170 cm di apertura alare. Possiedono una folta pelliccia solitamente di colore poco appariscente; la coda ha dimensioni variabili ma nello stesso tempo è sempre sottile, non ha una funzionalità prensile e può essere o meno compresa nella membrana.

Il muso varia da specie a specie e può somigliare a quello di un cane, di un topo, di una volpe o di un topo ragno.

Gli occhi sono generalmente piccoli, le labbra grandi come grandi sono anche le orecchie. Possiedono un cervello piccolo e di tipo primitivo.

Appena nati i pipistrelli hanno una specie di denti da latte molto appuntiti e uncinati che utilizzano per restare attaccati al capezzolo della mamma anche quando essa è in volo.

La dentatura definitiva varia da specie a specie e il numero dei denti è compreso tra i 20 e i 38. Tutte le specie, anche quelle che si nutrono di polline e frutta, possiedono denti canini.

Le orecchie posseggono un padiglione molto ampio dov'è collocata una piccola escrescenza chiamata trago che funziona con un diapason; quando sono in volo gli ultrasuoni emessi colpiscono gli oggetti è poi ritornano al pipistrello.

Questi impulsi sono onde ad altissima frequenza che l'uomo non può udire e che il pipistrello emette sia dalla bocca e dal naso.

Il pipistrello dai mustacchi emette 18 impulsi al secondo ed ognuno dura solo 4 ms; riesce a percepire gli oggetti soltanto se non superano i 4 m di lontananza. Al momento che identifica l'oggetto il pipistrello si avvicina e nello stesso tempo diminuisce la durata degli impulsi aumentandone però la frequenza e soltanto dopo la cattura dell'insetto le emissioni ritornano al ritmo regolare.

Le specie insettivore riescono, tramite gli impulsi, anche a capire la distanza dove si trova l'oggetto. I pipistrelli mangiatori di frutta invece utilizzano raramente gli impulsi sfruttando maggiormente la vista.

Anche le specie che vola ad altezze superiore ai 20 m utilizzano gli ecosuoni molto raramente.

I pipistrelli sono gli unici mammiferi che vivono in maniera stabile dentro le caverne. Oltre queste i loro nascondigli preferiti sono i canali, il sotto tetti, i ponti, le rocce e le gallerie. Si pensa che pipistrelli abbiano deciso di vivere in questi posti per sfuggire ai predatori, soprattutto uccelli; un problema che pipistrelli hanno dovuto risolvere, dopo aver mangiato, e la scarsa capacità di termoregolarsi.

I pipistrelli che vivono lungo il tropico hanno adottato una tecnica particolare: durante il giorno si avvolgono nelle ali isolandosi dal calore esterno; le specie invece che vivono nelle zone temperate possono adottare due soluzioni: o la migrazione o l'ibernazione.

Nelle zone temperate, quando arriva la stagione fredda, i pipistrelli insettivori incontrano molte difficoltà in quanto la loro fonte principale di nutrimento pressoché scompare. È per questo che quando giunge il momento, compiono delle migrazioni per raggiungere le zone meno fredde. Il ferro di cavallo maggiore si sposta in gruppi numerosissimi ma per brevi tragitti che non superano i 50 km anche, se ogni tanto, possono compiere migrazioni più lunghe.

La nottola compie migrazioni che possono arrivare a coprire anche i 1100 km anche grazie alla loro tecnica di volo che quella veloce e diretta. Il pipistrello nano compie migrazioni superiore ai 1500 km spostandosi dalla Russia per arrivare in Bulgaria.

Non si capisce ancora bene come facciano ad orientarsi per ritrovare i nascondigli abituali; molti pensano che riescano ad identificare il paesaggio tramite l'emissione di ultrasuoni che gli permetterebbero di localizzare la colonia. Altri pensano che utilizzi soprattutto la vista; altri studiosi ancora, sono convinti che utilizzino l'olfatto e l'udito. Verosimilmente possiamo dire che il pipistrello sfrutti tutte queste sue particolarità per orientarsi durante la migrazione.

Una teoria particolare, pensa che pipistrelli si orientino con le stelle e con i denti anche se attualmente ciò non è ancora stato dimostrato.